Домой Регистрация
Приветствуем вас, Гость



Форма входа

Население


Вступайте в нашу группу Вконтакте! :)




ПОИСК


Опросник
Используете ли вы афоризмы и цитаты в своей речи?
Проголосовало 514 человек


Поделки из лекарственных растений


Мастер-классы с материалом растения на Ярмарке Мастеров

Обними своих покупателей!

Присоединяйся к Программе привилегий

Уведомления

Моя Ярмарка

Лента новостей

Профиль

Настройки

Рекламные возможности

Покупки

Отзывы

Программа привилегий

Подписчики

Календарь

Блог

Избранное

Галерея коллекций

Гостиная

Ярмарка Талантов

Выход

28 сильнодействующих лекарственных растений для посадки в вашем саду

Растения предназначены не только для украшения бордюров или кормления вашей семьи. Вы также можете залечить раны, избавиться от головных болей и облегчить несварение желудка, используя растения, растущие прямо в собственном саду. Чаи, настойки и масла из лекарственных растений представляют собой естественную альтернативу тому, что можно найти в местной аптеке. Возможно, прямо сейчас у вас во дворе уже растет несколько из них.

Хотя у вас есть средства к существованию, покрытые вашим садом, ни один самодостаточный образ жизни не будет полным без нескольких лекарственных растений, которые помогут вам чувствовать себя хорошо.Мы покажем вам, какие растения вам понадобятся, чтобы вырастить собственную мини-аптеку прямо у себя дома.

Лекарственные растения

1. Розмарин (Rosmarinus officinalis)

Если вы похожи на меня и не любите острый аромат розмарина, вы можете выращивать его и использовать в лечебных целях.

Выносливость : Это популярное растение является многолетним растением в зонах 8 и выше.

Применение : Масло розмарина обладает полезными противовоспалительными и антибактериальными свойствами при местном применении.В виде чая розмарин считается ценным усилителем памяти.

Предупреждения : Никаких примечаний.

2. Пиретрум (Tanacetum parthenium)

Пиретрум, состоящий из маленьких цветков, напоминающих ромашки, легко прорастает и вырастает из семян.

Выносливость : пиретрум является многолетним в зонах 5-9.

Используйте : есть некоторые свидетельства того, что добавление пиретрума может снизить частоту приступов мигрени. Как сам страдающий мигренью, я всегда скептически отношусь к так называемым натуральным средствам, но есть свидетельства того, что партенолид, содержащийся в пиретруме, является эффективным профилактическим средством.Конечно, результаты сильно разнятся. Любой человек, страдающий мигренью, знает, что, к сожалению, то, что работает для одного человека, может не работать для другого.

Предостережения : Остерегайтесь ряда неприятных, но несерьезных побочных эффектов, от несварения желудка до тошноты. Больным аллергией следует избегать употребления пиретрума. Беременным или кормящим женщинам следует посоветоваться с врачом, прежде чем принимать пиретрум.

3. Алоэ вера (Алоэ вера)

Алоэ - широко распространенный ингредиент лосьонов и кремов для кожи, и для этого есть веская причина.Он творит чудеса с кожей.

Выносливость : Это нежное растение является многолетним в зонах 10 и выше, но также хорошо растет в помещении.

Используйте : Используйте слизистую гелеобразную внутреннюю часть для лечения ряда состояний от солнечных ожогов до укусов.

Предупреждения : Никаких примечаний.

4. Валериана лекарственная (Valeriana officinalis)

Это многолетнее растение, достаточно выносливое, чтобы выдержать большинство зимних условий, веками использовалось в медицине.

Выносливость : Многолетник в зонах с 4 по 9.

Использование : Валериана является полезным снотворным и расслабляющим средством. Это также помогает облегчить расстройство желудка.

Предупреждения : Если не обрезать и не ухаживать должным образом, валериана может стать инвазивной, чего вы особенно не хотите, потому что она ужасно пахнет. Люди сообщали о легких побочных эффектах, таких как головные боли и расстройство желудка.

5. Корень Бета (Trillium erectum)

Это лекарственное растение, также известное как красный триллий, имеет множество применений.Когда-то он широко использовался коренными американцами для помощи при родах.

Выносливость : Это красивое растение является многолетним в зонах с 4 по 9.

Использование : Вы можете изгнать временный лагерь с чаем, сделанным из корня этого растения. Он также полезен при несварении желудка и проблемах с дыханием, таких как астма.

Предупреждения : Никаких примечаний.

6. Аконит (Aconitum)

Это растение, также известное как Wolfsbane, увенчано красивыми фиолетовыми цветами.

Выносливость : Многолетнее растение в зонах от 2 до 9.

Применение : Аконит обладает седативными свойствами, а также способностью лечить головные боли. Это сильнодействующее лекарственное растение, и его следует использовать с особой осторожностью.

Предостережения : ЯДОВОДНО - это растение нельзя использовать без наблюдения врача.

7. Сушни (Marsilea quadrifolia)

Нежные листья клевера образуют сушни. Вы также можете есть листья, но это растение более известно своими стимулирующими свойствами.

Выносливость : Многолетник в зонах 8 и выше.

Использование: Это растение обладает успокаивающими свойствами, которые помогают бороться с бессонницей. Также было показано, что он снижает уровень холестерина.

Предупреждения : Нет.

8. Шерстистое ухо ягненка (Stachys byzantina)

Это пушистое растение, которое часто считают сорняком, не обязательно доставляет неудобства, если вам нужна удобная повязка для ран.

Выносливость : Ухо шерстистого ягненка является многолетним в зонах с 4 по 9.

Использование : это растение не следует есть или использовать для приготовления чая. Вместо этого мягкие листья когда-то использовались для прикрытия и перевязки порезов и царапин, и вы все еще можете использовать его таким образом сегодня. Это оригинальный пластырь!

Предупреждения : Нет.

9. Тюлень Соломона (Polygonatum)

Труднорастущее многолетнее растение, произрастающее в лесных средах.

Выносливость : Многолетник в зонах 5 и 6.

Применение : Это растение полезно для заживления ссадин кожи и снятия боли, связанной с ранами.

Предупреждения : Будьте осторожны, многие части этого растения ядовиты, включая ягоды.

10. Девясил (Inula helenium)

.

Оценка лекарственных растений на противоопухолевую активность

Растения использовались в медицинских целях с начала истории человечества и являются основой современной медицины. Большинство химиотерапевтических препаратов для лечения рака представляют собой молекулы, идентифицированные и выделенные из растений или их синтетических производных. Наша гипотеза заключалась в том, что экстракты цельных растений, отобранные в соответствии с исторически использовавшимися этноботаническими источниками, могут содержать несколько молекул с противоопухолевой активностью, которые могут быть очень эффективными в уничтожении раковых клеток человека.В этом исследовании изучали влияние трех экстрактов цельного растения (экстракция этанолом) на опухолевые клетки человека. Экстракты были из Urticambranacea (Urticaceae), Artemesia monosperma (Asteraceae) и Origanum dayi post (Labiatae). Все три экстракта растений продемонстрировали способность к уничтожению в зависимости от дозы и времени в различных линиях опухолевых клеток человеческого происхождения и первичных культурах, полученных из биопсий пациентов. Убивающая активность была специфичной по отношению к опухолевым клеткам, поскольку экстракты растений не влияли на первичные культуры здоровых клеток человека.Гибель клеток, вызванная экстрактами цельного растения, происходит через апоптоз. Растительный экстракт 5 ( Urticambranacea ) показал особенно сильные противораковые свойства, поскольку он подавлял фактическое прогрессирование опухоли на мышиной модели аденокарциномы молочной железы. Наши результаты показывают, что экстракты цельного растения являются многообещающими противораковыми реагентами.

1. Введение

По оценкам Международного агентства по изучению рака заболеваемости и распространенности основных типов рака на национальном уровне для 184 стран мира, их было 14.1 миллион новых случаев рака, 8,2 миллиона смертей от рака и 32,6 миллиона человек, живущих с раком (в течение 5 лет после постановки диагноза) в мире в 2012 году [1]. К 2030 году прогнозируется, что ежегодно будет 26 миллионов новых случаев рака и 17 миллионов смертей от рака [2].

Сегодня, несмотря на значительные усилия, рак по-прежнему остается агрессивным убийцей во всем мире. Более того, в течение последнего десятилетия новые синтетические химиотерапевтические агенты, используемые в настоящее время в клинической практике, не оправдали ожиданий, несмотря на значительную стоимость их разработки.

Поэтому существует постоянная потребность в разработке новых эффективных и доступных противоопухолевых препаратов [3]. На заре древней медицины химические соединения, полученные из растений, использовались для лечения болезней человека. Натуральные продукты привлекают все большее внимание за последние 30 лет из-за их потенциала в качестве новых профилактических и терапевтических агентов [4, 5]. Параллельно появляется все больше данных о потенциале соединений растительного происхождения в качестве ингибиторов различных стадий онкогенеза и связанных воспалительных процессов, что подчеркивает важность этих продуктов в профилактике и лечении рака.

Примерно 60% лекарств, используемых в настоящее время для лечения рака, были выделены из натуральных продуктов [6], и царство растений было наиболее важным источником. К ним относятся алкалоидов барвинка, дитерпенов Taxus, алкалоидов Camptotheca и Podophyllum lignans . В настоящее время из 16 новых соединений растительного происхождения, которые проходят клинические испытания, 13 находятся в фазе I или II, а три - в фазе III [7]. Среди этих соединений флавопиридол , выделенный из индийского дерева Dysoxylum binectariferum , и мейзоиндиго , выделенный из китайского растения Indigofera tinctoria , показали противораковое действие с меньшей токсичностью, чем обычные препараты [7].Лекарственные растения представляют собой распространенную альтернативу лечению рака во многих странах мира [8, 9]. В настоящее время сообщается, что более 3000 растений во всем мире обладают противораковыми свойствами. В глобальном масштабе распространенность продуктов растительного происхождения для лечения рака составляет от 10% до 40%, причем этот показатель достигает 50% у пациентов из Азии [9–11]. Только в Европе расходы на противораковые растительные продукты оцениваются в 5 миллиардов долларов в год [9].

Израиль с его разнообразными климатическими и географическими условиями является домом для около 2400 видов растений [12].Расположенный в переходной зоне между средиземноморскими лесами на севере, кустарниковыми образованиями и травянистой растительностью на востоке и юге, кустарниковыми степями и крайними пустынными районами на юге Негева и тропической растительностью в самых жарких частях страны, Израиль обладает огромным разнообразие видов, многие из которых являются эндемиками только этой области. Лекарственные растения Израиля, имеющие долгую историю традиционного использования, охватывающую многие века, представляют уникальную возможность для целенаправленного скрининга на основе их этноботанического использования.

В текущем исследовании мы первоначально исследовали влияние 17 экстрактов цельных растений (экстракция этанолом) израильских растений на линии опухолевых клеток человека, а также на первичные культуры рака человека. Затем были отобраны три наиболее эффективных экстракта растений для дополнительных исследований, посвященных также природе гибели клеток, вызываемой этими экстрактами растений. Наша гипотеза заключалась в том, что экстракты целых клеток могут содержать несколько молекул с противоопухолевой активностью и быть очень эффективными в уничтожении раковых клеток человека.

Были исследованы 3 экстракта растений: Urticambranacea (Urticaceae) (в исследовании обозначается как экстракт 5), Artemesia monosperma (Asteraceae) (обозначается как экстракт 10) и Origanum dayi Post ( Labiatae) (упоминается как экстракт № 11).

Все растения были исследованы в рамках проекта Ближневосточных лекарственных растений (MEMP) , инициативы Исследовательского центра естественной медицины (NMRC), посвященной этноботаническим исследованиям, одомашниванию, сохранению и реинтродукции, а также целенаправленному скринингу израильских лекарственных растений. флора [13].

Все три выбранных экстракта растений проявляли дозозависимую и зависящую от времени способность к уничтожению в различных линиях гематологических и солидных опухолевых клеток человека, а также в первичных культурах, полученных из биопсий пациентов. Убивающая активность была специфичной в отношении опухолевых клеток, поскольку экстракты не влияли на первичные культуры здоровых клеток человека (лимфоцитов и фибробластов). Было проведено несколько экспериментов для характеристики активности растительных экстрактов. С помощью различных методов было обнаружено, что при использовании экстрактов цельных растений гибель клеток вызывалась апоптозом.

Растительный экстракт 5 также продемонстрировал сильные противораковые свойства, подавляя реальное прогрессирование опухоли на мышиной модели аденокарциномы молочной железы. Наши результаты показывают, что экстракты цельного растения являются многообещающими противораковыми реагентами.

2. Материалы и методы
2.1. Выбор растений

Растения были отобраны для скрининга с использованием целенаправленного метода, основанного на этноботанической информации, полученной из базы данных медицинских растений Центра исследований естественной медицины (NMRC), содержащей более 500 видов израильских видов, используемых в традиционной и народной медицине, и на основе методов сбора данных с использованием дополнительных источников в том числе средневековые фармакопеи и медицинские энциклопедии, переведенные с оригинальных латинских, еврейских и арабских текстов.

Отобранные растения были собраны из диких источников или собраны из одомашненных растений, полученных из семян, полученных из диких растений. Одомашнивание проводилось на участке выращивания MEMP в кибуце Кетура, в южном регионе Израиля Арава (засушливые и пустынные виды) и в мошаве Ноам на прибрежной равнине (средиземноморские виды). Растения выращивали без использования удобрений и пестицидов, используя затененные сетчатые домики и капельное орошение. Сбор дикорастущих растений проводился совместно с Ms.Хагар Лешнер и доктор Ори Фрагман-Сапир. Весь растительный материал был окончательно идентифицирован доктором Ори Фрагман-Сапир или г-жой Хагар Лешнер, а образцы гербариев были депонированы в Иерусалимском ботаническом саду.

2.2. Экстракты растений (экстракция этанолом)

Свежесобранные растения сушили на воздухе при комнатной температуре и экстрагировали этанолом (50% об. / Об., 10 об. На грамм веса) путем интенсивного перемешивания в закрытом химическом стакане в течение 24 часов при комнатной температуре, после чего процесс повторился.Супернатант обоих экстрактов фильтровали и этанол выпаривали в химическом вытяжном шкафу в течение 4 дней с замороженным выпаренным экстрактом при -70 ° C с последующей лиофилизацией досуха. Высушенный экстракт хранили при 4 ° C. Исходные растворы экстрактов растений (200 мг / мл) готовили путем взвешивания порошка и растворения его в 10% ДМСО / PBS. Раствор разделяли на аликвоты и хранили при -20 ° C до использования.

2.3. Клеточные линии

Линии раковых клеток человека HepG2, OVCAR 3, 293, A549, T24P и SU-DHL-1 и линии клеток мыши D122 и B16 выращивали в среде DMEM с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS), 1 мМ L-глутамин, 100 единиц / мл пенициллина и 100 мкг г / мл стрептомицина.

Линии раковых клеток человека Hec1A, Karpas, HUT102, Colo205, LNCaP, MCF-7, YC и OSTRA выращивали в среде RPMI 1640 с добавлением 10% FCS и антибиотиками, как указано выше. Клетки мыши E0771 выращивали в среде F-12 (HAM’S), содержащей 10% FCS, 1 мМ L-глутамин, 10 мМ HEPES и антибиотики, как указано выше.

Первичные раковые культуры человека выращивали в среде RPMI 1640, содержащей 1% заменимых аминокислот, 1% пирувата натрия, 1% бикарбоната натрия, 20% FCS, 10 мкМ M -меркаптоэтанола, 1 мМ L-глутамина и антибиотики в виде над.

Все среды и добавки были приобретены у Biological Industries (Бет Хаэмек, Израиль). Клетки хранили в увлажненной атмосфере с 5% CO 2 при 37 ° C. Все культуры были протестированы на контаминацию микоплазмами и оказались отрицательными.

2.4. Выделение первичных лимфоцитов человека от здоровых доноров

Мононуклеарные клетки периферической крови человека (PBMC) от здоровых доноров (полученные из Медицинского центра банка крови Хадасса) выделяли на градиенте фиколл-изопак (плотность 1.077; Сигма-Олдрич, Сент-Луис, Миссури, США). Затем выделенные РВМС подсчитывали и проверяли на жизнеспособность с использованием трипанового синего и использовали на индивидуальной основе. Для активации лимфоцитов все мононуклеарные клетки выращивали в RPMI 1640 с добавлением 10% (об. / Об.) FCS, 2 мМ L-глутамина, 100 единиц / мл пенициллина, 100 мкг г / мл стрептомицина, 10 мк мкМ -меркаптоэтанол и фитогемагглютинин (PHA 20 μ г / мл) в течение 3 дней. Активированные клетки промывали и ресуспендировали в присутствии 10 единиц / мл рекомбинантного IL-2 (PeproTech EC Ltd., Лондон, Великобритания) для поддержания жизнеспособности клеток. Наивные лимфоциты выращивали в среде RPMI 1640 с добавлением 10% (об. / Об.) FCS, 2 мМ L-глутамина, 100 единиц / мл пенициллина, 100 мкг мкг / мл стрептомицина и 10 мкМ М -меркаптоэтанола.

2,5. Первичные раковые культуры человека

Образцы свежих тканей были взяты у онкологических больных, подвергшихся терапевтическим процедурам удаления опухоли. Все образцы тканей несколько раз промывали средой Лейбовица (L15), измельчали ​​и подвергали ферментативному протеолизу в течение 2 ч при 37 ° C с осторожным встряхиванием в среде Лейбовица, содержащей коллагеназу типа I (200 единиц / мл), гиалуронидазу (100 единиц / мл). мл) (Sigma-Aldrich), пенициллин (1000 единиц / мл), стрептомицин (1 мг / мл) и амфотерицин B (2.5 μ г / мл). Тканевые препараты центрифугировали в течение 10 минут при 200 g, осадки суспендировали в среде RPMI 1640, содержащей все добавки, и высевали в чашки Петри диаметром 100 мм. Через 1–3 недели, когда культуры достигли плотности клеток на чашку, проводили гистопатологический диагноз и анализ жизнеспособности клеток (см. Ниже).

2.6. Жизнеспособность клеток

10 4 /100 μ л / лунка клеток, растущих в суспензии или 5 × 10 3 /100 μ л / лунка прикрепленных клеток были засеяны и обработаны растительными экстрактами с возрастающей концентрацией в течение 48 –72 ч, после чего добавляли реагент CellTiter-Blue (Promega, Мэдисон, Висконсин, США) в соответствии с инструкциями производителя для определения выживаемости клеток.Все процедуры были выполнены в трех экземплярах.

2.7. Анализ клеточного цикла окрашиванием пропидиум иодидом (PI)

0,3 × 10 6 / 3,5 мл Клетки Hec1A обрабатывали экстрактами растений (1,5 мг / мл, конечная концентрация) в течение от 6 до 48 часов. Образцы отбирали для анализа жизнеспособности клеток, а оставшиеся клетки центрифугировали при 500 g в течение 6 минут при 4 ° C, промывали холодным PBS и ресуспендировали в 0,5 мл гипотонического раствора PI (50 мкг г / мл PI; 0,1 % цитрата натрия; 0.1% тритон Х100). После инкубации в течение ночи при 4 ° C анализ клеточного цикла клеток выполняли с использованием FACScan и программы CellQuest (Becton Dickinson).

2,8. In Vitro Анализ активности каспазы 3

10 5 /100 мкк л / лунка Клетки Colo205 обрабатывали экстрактами растений (1,5 мг / мл, конечная концентрация) в течение 24–48 часов. Активность каспазы 3 в клетках оценивали с помощью набора для анализа гомогенной каспазы 3/7 Apo-ONE (Promega). Эксперименты проводились параллельно с анализами жизнеспособности клеток.

2.9. Вестерн-блоттинг

Образцы разделяли на 12% SDS-PAGE гелях. Затем белки переносили электропереносом на мембрану для переноса Immobilon-P (Millipore, Millipore, Брэдфорд, Массачусетс, США) и подвергали блоттингу анти-PARP (Cell Signaling Technology, Inc, Бостон, США; 1: 1000). Визуализация полос была достигнута с использованием набора для усиленной хемилюминесценции (ECL, Biological Industries).

2.10. ДНК-маркер

0,5 × 10 6 /3 мл клеток Colo205 засевали и добавляли растительные экстракты (1.5 мг / мл, конечная концентрация) в течение 24, 48 или 72 часов. Затем клетки собирали, дважды промывали PBS, ресуспендировали в 4 мл буфера для лизиса (15 мМ Трис-HCl pH 7,4, 3 мМ EDTA pH 8,0, 150 мМ NaCl, 0,2% SDS, 10 мкл г / мл протеиназы K и 50 мкг мкг / мл РНКазы) и инкубировали в течение ночи при 37 ° C. Затем ДНК экстрагировали с помощью следующей процедуры: добавляли 4 мл фенола / хлороформа (соотношение 1: 1 к объему буфера для лизиса) и раствор центрифугировали при 3150 g в течение 5 минут при комнатной температуре.Верхнюю фазу отделяли и добавляли объем хлороформа 1: 1. Затем раствор снова центрифугировали при тех же условиях и собирали верхнюю фазу. Концентрацию NaCl доводили до 0,5 М. Добавляли два объема абсолютно холодного (-20 ° C) этанола и раствор инкубировали при -70 ° C в течение 1 ч, чтобы дать возможность осадку ДНК сформироваться. Затем осадок выделяли центрифугированием при 10000 g в течение 30 мин при 4 ° C. Осадок дважды промывали 70% холодным этанолом, сушили на воздухе и ресуспендировали в 10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА, pH 8.0. Конечная концентрация была измерена с помощью машины для нанесения нанокапель. 10 мкМ г ДНК каждого образца наносили на 1,5% агарозный гель.

2.11. Анализ ПЦР в реальном времени мРНК, связанных с апоптозом, в клетках, обработанных Colo205

0,5 × 10 6 / 3,5 мл Клетки Colo205 обрабатывали 1,5 мг / мл (конечная концентрация) экстрактов 5, 10 и 11 в течение 3–24 час Суммарную мРНК экстрагировали и обратно транскрибировали в кДНК с использованием набора Verso cDNA (Thermo Specific, Epsom, Surrey, UK). Индивидуальные уровни мРНК были количественно определены с помощью ПЦР в реальном времени (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).Каждый образец 2 мкл л содержал 1 мкл л праймеров (10 нг), 10 мкл л SYBR Green (Applied Biosystems) и 7 мкл LH 2 O в общем объеме 20 мк L на образец. Праймеры были следующими: Bax (экзоны 4-5, 116 п.н.) Смысл: TCT GAC GGC AAC TTC AA CTG; Антисмысловые: CAG CCC ATG ATG GTT CTGA; Bcl2 (экзоны 2-3, 134 п.н.) Смысл: CCC CTG GTG GAC AAC ATC; Антисмысловые: CAG CCA GGA GAA ATC AAA CAG; Каспаза 3 (экзоны 7-8, 133 п.н.) Смысл: GAA CTG GAC TGT GGC ATT GA; Антисмысловые: CCT TTG AAT TTC GCC AAG AA; G6PD (экзоны 6-7, 283 п.н.) Смысл: TCT ACC GCA TCG ACC ACT ACC; Антисмысловые: GCG ATG TTG TCC CGG TTC.

Данные анализировали с помощью программы экспресс-праймеров (Applied Biosystems).

2.12. Влияние экстракта растения 5 на рост рака молочной железы у мышей
Мышей

C57BL / 6JolaHsd облучали 500RAD / 5 GREY, оставляли на один день для восстановления, а затем подкожно вводили 10 5 клеток E0771 в нижнюю часть спины. Лечение начиналось через день после индукции опухоли и состояло из ежедневного внутрибрюшинного введения. инъекций 150 мкг г (в 300 мк л) экстракта 5, в течение 12 дней.Контрольным мышам вводили эквивалентный объем ДМСО / PBS в той же концентрации, что и в экстракте 5. В конце эксперимента мышей умерщвляли; опухоли были удалены и взвешены.

3. Заявление об этике

Мононуклеарные клетки периферической крови человека от здоровых доноров и биопсии от больных раком были получены в соответствии с руководящими принципами, утвержденными Комитетом по этике больницы Хадасса (Иерусалим, Израиль). Все субъекты предоставили письменное информированное согласие.

Все процедуры с участием мышей были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Еврейского университета Иерусалима, номер разрешения MD-07-10429-5.Это исследование было проведено в соответствии с Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных (номер одобрения NIH OPRR-A01-5011). Мышей содержали в клетках с автоклавной подстилкой и снабжали крышками-фильтрами в соответствии с протоколами содержания, до пяти животных в клетке. Поддерживали 12-часовой цикл свет / темнота, и мыши имели доступ к воде и лабораторному корму на грызунах ad libitum.

4. Результаты
4.1. Скрининг растений на их противоопухолевую активность

Изначально были отобраны 17 растений и протестированы на противораковую активность на основе их исторического и традиционного использования для лечения рака.Были приготовлены цельные растительные экстракты (экстрагированный этанолом), обозначенные номерами 1–17 растительных экстрактов, и испытаны на их потенциальные противораковые свойства. Мы протестировали множество линий раковых клеток, происходящих из различных опухолей человека, включая гематопоэтические опухоли, такие как Т-клеточная лимфома и лейкоз, а также солидные опухоли, такие как толстая кишка, почки, груди, мочевой пузырь, эндометрий и другие (таблица 1). Это было сделано путем тщательного мониторинга жизнеспособности культивируемых клеток человека, подвергшихся воздействию растительных экстрактов.

Аденокарцинома аденокарцинома карцинома молочной железы a Т-клеточная неходжкинская лимфома 9019 лимфома EB19 нормальная 200 OSTRA

Клеточная линия Тип

LNCaP Аденокарцинома предстательной железы
OVCAR 3 Карцинома яичников
HepG2 Гепатоцеллюлярная карцинома
MCF-7 Протоковая карцинома молочной железы
A549 Альвеолярная базальная эпителиальная аденокарцинома-легкое
SU-DHL-1 Анапластическая крупноклеточная лимфома
Нормальные лимфобласты, трансформированные EBV
HUT 102 Т-клеточная лимфома
T24P Карцинома мочевого пузыря

мг мл, конечная концентрация) подавляла рост различных линий опухолевых клеток человека, что в конечном итоге приводило к гибели клеток.Эффективность гибели клеток варьировалась в зависимости от конкретного экстракта растения (рис. S1 A – C в дополнительных материалах, доступных на сайте http://dx.doi.org/10.1155/2014/721402).

Также оценивалась специфичность растительных экстрактов в отношении раковых клеток. Нормальные лимфобластные клетки человека (трансформированные EBV) (клетки OSTRA и YC; таблица 1) не подвергались воздействию растительных экстрактов (рис. S1 A – C). Таким образом, экстракты растений цитотоксичны по отношению к установившимся линиям раковых клеток человека, но не влияют на здоровые клетки человека.На основании повторных анализов для дальнейших исследований были выбраны три наиболее эффективных экстракта противораковых растений: 5, 10 и 11.

4.2. Гибель клеток, индуцированная экстрактом растений, зависела от времени и концентрации

Три наиболее эффективных противораковых экстракта растений 5, 10 и 11 были сначала протестированы на их влияние на линии раковых клеток при двух более низких концентрациях. Как видно на Фигуре 1, три экстракта растений подавляли рост клеток также при более низких концентрациях с различной эффективностью в зависимости от конкретного экстракта растения и тестируемой линии раковых клеток.Ингибирование роста клеток также зависело от времени, как показано на фиг. 2 (а) и 2 (b). Экстракты растений 5, 10 и 11 были протестированы также на первичных лимфоцитах от здоровых контрольных доноров и не показали убивающей активности в отношении этих клеток (рис. 2 (c)). Таким образом, экстракты растений 5, 10 и 11 проявляли зависящую от времени и концентрации противораковую активность, но не влияли на первичные культуры клеток здоровых людей.

4.3. Влияние экстрактов растений на первичные культуры, полученные от больных раком

Для изучения цитотоксичности наших растительных экстрактов против клеток, похожих на исходные опухоли in vivo , насколько это возможно, первичные культуры были получены из биопсий двух разных больных раком (толстой кишки больные раком и раком груди).Как видно на фиг. 2 (d) и 2 (e), экстракт 5 очень быстро влиял на рост клеток, как это было видно на установленных клеточных линиях. Экстракты 10 и 11 вызывают более медленную гибель клеток; однако их убивающая активность увеличивалась через 72 часа после начала лечения. Следует отметить, что, хотя рост клеток первичных культур клеток был ингибирован примерно на 60%, эта убивающая активность намного ниже, чем измеренная в установленных клеточных линиях (см. Рисунок S1 и 1-2). Это можно объяснить тем фактом, что первичные культуры, скорее всего, не являются гомогенными, а скорее представляют собой смешанную популяцию клеток, включая здоровые нормальные клетки, для которых экстракты растений не были цитотоксичными.

4.4. Механизм цитотоксичности
4.4.1. Влияние экстрактов растений на клеточный цикл раковых клеток эндометрия Hec1A

На поздних стадиях апоптоза клетки расщепляются с образованием апоптотических тел. Каждое апоптозное тело содержит только часть ДНК исходной клетки. При окрашивании PI эта популяция известна как популяция sub-G1 и характеризуется содержанием ДНК менее 2n хромосом. Кроме того, апоптотические клетки демонстрируют специфические морфологические изменения, такие как конденсация хроматина и образование пузырей на плазматической мембране.Эти изменения приводят к тому, что ячейка становится более гранулярной и крупнее по размеру при анализе с помощью FACS.

Чтобы продемонстрировать влияние наших растительных экстрактов на клеточный цикл, клетки аденокарциномы эндометрия HeC1A обрабатывали тремя экстрактами (1,5 мг / мл каждый, конечная концентрация) в течение разных периодов времени и анализировали с помощью FACS. Результаты показаны на фиг. 3. Экстракт 5

вызывал ~ 13% увеличение популяции клеток суб-G1 через 24 часа. Это увеличение сопровождалось уменьшением количества клеток на 14% в фазе G1 (рис. 3 (а)).Экстракт 11 вызывал резкое увеличение (40%) количества клеток в G2 без видимых изменений в популяции клеток суб-G1 (рис. 3 (b)). Экстракт 10 вызвал увеличение популяции клеток суб-G1 (увеличение на 9,4%, рис. 3 (c)), уменьшение (с 43,26% до 20,79%) клеток в G1 и значительное увеличение (с 25,26% до 39%). в ячейках на G2 (рис. 3 (c)). Эти результаты показывают, что экстракты 5 и 10 вызывают классическую апоптотическую гибель клеток, в то время как экстракт 11 вызывает гибель по другому механизму.

4.4.2. Повышение активности внутриклеточной каспазы 3 после обработки экстрактами растений

Активация внутриклеточной каспазы 3 является ключевой стадией в пути апоптоза. Таким образом, мы проверили влияние обработки нашими экстрактами растений на внутриклеточную ферментативную активность каспазы 3. Клетки рака толстой кишки человека (Colo205) обрабатывали экстрактами растений или этопозидом, известным индуктором апоптоза, и ферментативную активность каспазы 3 в клетках измеряли с использованием синтетического субстрата (рисунки 4 (а) и 4 (b)).В этих экспериментах измеряли общую активность каспазы 3 для всей популяции клеток. Поскольку активность каспазы 3 повышается, когда клетки умирают, а их количество падает, для получения более точных результатов было важно нормализовать активность каспазы 3 до количества клеток. Таким образом, идентичные образцы были проанализированы одновременно на жизнеспособность клеток (рис. 4 (б)). Результаты здесь выражены как кратное увеличение активности каспазы 3 в обработанных клетках по сравнению с клетками, добавленными с ДМСО / PBS (в той же конечной концентрации, что и в экстрактах растений; контрольные клетки).

Обработка экстрактом 5 увеличивала ферментативную активность каспазы 3 в 3,2 раза через 24 часа и в 5,9 раза через 48 часов (рис. 4 (а)), что свидетельствует об индукции апоптоза. Аналогичное увеличение активности каспазы 3 наблюдалось после обработки экстрактом 10 (в 1,8 раза через 24 часа и в 6,1 раза через 48 часов; рисунок 4 (а)). Растительный экстракт 11 практически не увеличивал активность каспазы 3 в обработанных клетках (фиг. 4 (а)). В клетках Colo205, подвергнутых воздействию этопозида в качестве положительного контроля апоптоза, каспаза 3 увеличивалась на 4.В 4 раза после 48 ч лечения (рис. 4 (а)). Результаты показывают, что экстракты растений 5 и 10 вызывали апоптотическую, зависимую от каспазы-3 смерть, а экстракт 11 вызывали смерть по независимому от каспазы-3 механизму. Эти результаты соответствуют влиянию экстрактов на клеточный цикл (см. Рисунок 3).

4.4.3. Растительный экстракт 5 вызывает расщепление PARP в клетках Colo205

Другой способ продемонстрировать, что смерть, вызванная экстрактами растений, происходит через классический каспазо-3-зависимый апоптоз, - это проследить один из субстратов каспазы 3, поли (АДФ-рибоза) полимеразу (PARP ) белок, который расщепляется при апоптотическом сигнале.Клетки Colo205 обрабатывали экстрактом 5 в течение 2 или 4 часов и готовили клеточные лизаты. Как видно на фиг. 4 (c), после обработки белок PARP был расщеплен на его известный более короткий фрагмент ~ 89 кДа. Это подтвердило, что смерть, вызванная растительным экстрактом 5, действительно происходит через каспазо-3-зависимый апоптоз.

4.4.4. Апоптоз, индуцированный растительным экстрактом 5, как продемонстрировано с помощью ДНК-лестницы

Фрагментация ДНК является хорошо известным биохимическим признаком апоптоза. Одним из многочисленных белков, расщепляемых каспазой 3, является DFF45.При расщеплении DFF45 высвобождает и активирует эндонуклеазу DFF40, которая разрывает цепи ДНК в межнуклеосомных областях, образуя фрагменты различной длины; эти фрагменты образуют уникальный лестничный узор.

Клетки Colo205 обрабатывали растительным экстрактом 5 (1,5 мг / мл, конечная концентрация) в течение различных периодов времени. Этопозид использовали в качестве положительного контроля. После обработки экстрактом 5 в течение 72 часов клетки Colo205 демонстрируют структуру ДНК, аналогичную той, которая была получена с использованием этопозида, что указывает на то, что наш экстракт 5 индуцировал апоптотическую фрагментацию ДНК (рис. 4 (d)).

4.4.5. Влияние растительных экстрактов на уровни экспрессии апоптотических белков

Мы исследовали влияние растительных экстрактов на уровни экспрессии апоптотических белков с помощью ПЦР в реальном времени. Как видно на фиг. 5, обработка растительным экстрактом 5 вызвала 2,5-кратное увеличение клеточных уровней мРНК Bax. Увеличение клеточной экспрессии было резким для уровней Bik-мРНК (> 25 раз), достигая пика через 6 часов. Напротив, экспрессия Bcl-2 снижалась после лечения.Растительный экстракт 10 вызывал аналогичные изменения в экспрессии тестируемых апоптотических белков (2-кратное увеличение мРНК Bax, 9-кратное увеличение мРНК Bik и снижение мРНК Bcl-2; фиг. 5). Экстракт 11 вызывал различный ответ в клетках Colo205, позднее (12 часов) и умеренное увеличение мРНК Bax и Bik (в 1,5 и 1,7 раза, соответственно) и конститутивное увеличение мРНК Bcl-2.

4.5. Влияние экстракта растения 5 на рост рака молочной железы у мышей

Чтобы проверить действие экстрактов на модели in vivo на мышах , мы сначала проверили их действие на трех раковых клетках мышей: меланоме B16, карциноме легкого D122 и E0771 Клетки карциномы молочной железы.Было обнаружено, что растительный экстракт 5 является наиболее эффективным в отношении клеток E0771 (результаты не показаны), и поэтому был выбран для тестирования in vivo на модели рака груди E0771 на мышах.

Сначала неспецифическая токсичность экстракта 5 была протестирована на самцах мышей C57BL / 6JolaHsd однократным внутрибрюшинным введением. инъекции увеличивающегося количества экстракта 5. Мышей наблюдали в течение трех недель на предмет жизненных показателей и взвешивали дважды в неделю. Было обнаружено, что введение до 150 мкг г растительного экстракта 5 безопасно и не оказывает токсического воздействия на мышей.

Затем мышам C57BL / 6JolaHsd инъецировали клетки рака молочной железы мыши E0771 и обрабатывали экстрактом 5 (см. Методы, раздел 2.12). Как показано на Фигуре 6 (а), опухоли мышей, получавших экстракт 5, весили примерно на 50% меньше, чем опухоли мышей, получавших только ДМСО / PBS (носитель). На Фигуре 6 (b) показаны опухоли из обеих групп, что подчеркивает значительную разницу в размере опухоли у обработанных мышей по сравнению с контрольными мышами. Таким образом, растительный экстракт 5 подавляет рост опухоли in vivo на модели рака груди у мышей.

5. Обсуждение

Лекарственные растения на протяжении веков традиционно использовались в народной медицине в качестве естественных лечебных средств со значительными доказанными терапевтическими эффектами во многих областях, включая профилактику сердечно-сосудистых заболеваний и противовоспалительную, антимикробную и противораковую активность. Кроме того, появление устойчивости к химиотерапии рака заставило исследователей обратиться к натуральным продуктам растительного и морского происхождения.

Хотя многие соединения, выделенные из растений, проходят тщательные испытания на их противораковые свойства, становится все более очевидным, что полезные эффекты растений обусловлены сложным взаимодействием сложной смеси соединений, присутствующих во всем растении (аддитивные / синергетические и / или антагонистические), а не отдельные агенты [14, 15].С таким настроем мы стремились провести детальную оценку противораковой активности in vitro, и in vivo, ряда экстрактов цельных растений Израиля.

Мы исследовали противоопухолевые свойства в основном 3 экстрактов растений, произрастающих в Израиле: Urticambranacea (Urticaceae; экстракт номер 5), Artemesia monosperma (сложноцветные) (экстракт номер 10) и Origanum dayi Post (Labiatae). (выписка №11).

Artemisia monosperma . Artemisia monosperma (растительный экстракт 10) - это сизый, голый, карликовый кустарник, широко произрастающий в песчаной растительности западного Негева, северного Синая и прибрежных песков Израиля. Род Artemisia , насчитывающий около 400 видов, в основном в Северном полушарии, известен своим широким использованием в традиционной медицине и широким спектром биологической активности, включая противомалярийную, цитотоксическую, антигепатотоксическую, антибактериальную, противогрибковую и антиоксидантную активность [16].Основные классы фитосоставов, обнаруженных в роде Artemisia , включают терпеноиды, флавоноиды, кумарины, кофеилхиновые кислоты, стерины и ацетилены [16].

Анализ эфирного масла стебля и листа A. monosperma выявил 130 компонентов [17]. Сесквитерпен эудесмана, присутствующий в A. monosperma [18], был связан с апоптотической гибелью клеток в клеточной линии меланомы человека A375 [19].

Несколько других соединений, выделенных из A.monosperma продемонстрировали специфическую противоопухолевую активность in vitro против линий клеток колоректального рака и рака груди под действием полиацетилендегидрофалькариндиола [20]. Капиллин (1-фенил-2,4-пентадиин), еще один полиацетилен, обнаруженный в A. monosperma , вызывает апоптоз в нескольких линиях опухолевых клеток человека, включая HT29 толстой кишки, MIA PaCa-2 поджелудочной железы, эпидермоидную карциному гортани. HEp-2 и клетки карциномы легкого A549 [21].

В этом исследовании мы продемонстрировали, что A.Экстракт цельного растения monosperma обладает противораковой активностью в отношении по меньшей мере 10 различных опухолевых клеток человека и двух первичных опухолевых культур, вызывая гибель этих опухолевых клеток в результате апоптоза.

Origanum dayi Post . Origanum dayi Post (растительный экстракт 11) - это многолетний полукустарник, эндемичный для пустынных регионов Израиля, включая северный Негев и Иудейскую пустыню. Представители рода Origanum , которых насчитывается около 10 средиземноморских и сахаро-арабских видов, обладают ароматическими ароматическими веществами и широко используются с древних времен в качестве кулинарных трав и в лечебных целях [13, 22].Один из основных компонентов эфирного масла 1,8-цинеола O. dayi был связан с подавлением роста клеточных линий лейкемии человека Molt 4B и HL-60 из-за индукции апоптоза этим соединением [23].

Карвакрол, монотерпен, обнаруженный в меньших количествах в O. dayi , оказался мощным ингибитором роста клеток линии клеток немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) человека, A549 [24]. Экстракты цельных растений O. dayi также недавно были связаны с антипролиферативным эффектом in vitro в клетках HepG2 [25].

В нашем исследовании экстракт цельного растения O. dayi проявил сильную противораковую активность в отношении линий опухолевых клеток человека, а также первичных опухолевых культур. Однако смерть, вызванная его экстрактом, вызвала гибель опухолевых клеток, скорее всего, по независимому от каспазы-3 механизму. Следует отметить, что одной из основных проблем традиционной противоопухолевой терапии является множественная лекарственная устойчивость (МЛУ), при которой клетки приобретают устойчивость к структурно и функционально несвязанным лекарствам после химиотерапевтического лечения.Одна из основных причин МЛУ - сверхэкспрессия транспортера Р-гликопротеина. Помимо экструдирования химиотерапевтических препаратов, он также ингибирует апоптоз за счет ингибирования каспаз. Таким образом, экстракт цельного растения O. dayi может преодолеть МЛУ и должен быть протестирован на его противораковый потенциал против опухолевых клеток человека, устойчивых к химиотерапевтическим препаратам.

Крапивница перепончатая . Urticambranacea (растительный экстракт 5), один из 4 видов рода Urtica , обнаруженных в Израиле, отличается большими листьями и колющими волосками и является обычным однолетником в средиземноморских лесах и кустарниках. U.mbranacea относительно мало изучен по сравнению с другими, более широко изученными представителями этого рода, который насчитывает около 40 видов, обитающих в основном в регионах с умеренным климатом с долгой историей использования в медицине, включая артрит, сенную лихорадку, тонизирующие средства, экзему, геморрой, гипертиреоз, бронхит и рак [26].

Противоопухолевая активность была показана в ряде исследований на U. dioica , особенно при росте простаты, включая антипролиферативные свойства на клетки рака простаты человека [27], ингибирование мембран, активность АТФазы при доброкачественной гиперплазии простаты через стероидный компонент U.dioica root [28], и модуляция глобулина, связывающего половые гормоны, с его рецептором на мембранах простаты человека [29]. Тем не менее, как уже упоминалось, было проведено очень мало исследований по U.mbranacea .

Исследования растений, используемых в Калабрии (южная Италия) в народной медицине растений, были выполнены Passalacqua et al. в течение двадцати лет. Описано использование 104 таксонов, разделенных на 42 семейства. Одним из основных открытий было то, что U.mbranacea используется при кашле и тонзиллите [30].Однако не сообщалось о влиянии на рак.

Здесь мы показываем, что весь экстракт U.mbranacea очень эффективен в уничтожении большого количества опухолевых клеток человека, а также первичных культур человека (рис. 1-2). Кроме того, смерть наступает из-за апоптоза (рис. 3–5). Более того, экстракт U.mbranacea ингибировал рост опухоли in vivo на модели рака груди у мышей (фиг. 6). U.mbranacea , как и O. dayi , съедобен и нетоксичен для человека.

Рак разработал несколько механизмов, позволяющих избежать регулируемого роста и избежать апоптоза. Таким образом, использование экстрактов целых клеток, которые содержат несколько компонентов, имеющих различные возможные внутриклеточные мишени, может обеспечить преимущество перед использованием одного изолированного растительного соединения. Поскольку большинство протестированных растений имеют длительную историю перорального применения, особенно виды Urtica и Origanum , и, по всей видимости, нетоксичны, существует возможность разработки экстрактов цельных растений для лечения рака отдельно, в сочетании с другими лекарствами или в качестве возможно, профилактическое лечение путем добавления к ежедневному рациону является многообещающим.Тем не менее, перед любым конкретным использованием на людях для лечения рака эти растения должны быть дополнительно протестированы, включая дополнительные исследования in vivo, исследований на животных моделях и клинические испытания на людях.

6. Выводы

Экстракты целых клеток (экстракция этанолом) из Urticambranacea (Urticaceae), Artemesia monosperma (Asteraceae) и Origanum dayi post (Labiatae), растений, произрастающих в прибрежных равнинах и пустынях. Израиля, продемонстрировали дозозависимую и зависящую от времени способность уничтожать различные гематологические и солидные опухолевые клеточные линии человеческого происхождения и первичные культуры, полученные из биопсий пациентов.Убивающая активность была специфичной по отношению к опухолевым клеткам, поскольку экстракты растений не влияли на первичные культуры здоровых клеток человека. Гибель клеток, вызванная экстрактами цельного растения, происходила через апоптоз. Экстракт растения Urticambranacea показал особенно сильные противоопухолевые свойства, поскольку он подавлял реальное прогрессирование опухоли на мышиной модели аденокарциномы молочной железы. Наши результаты показывают, что экстракты цельного растения являются многообещающими противораковыми реагентами.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в связи с публикацией данной статьи.

Благодарности

Авторы выражают признательность и благодарность за их щедрую поддержку исследованиям: The Merrin Family Foundation; Г-жа Луиза Гартнер и семейный фонд Gartner и благотворительный фонд Чарльза Вольфсона. Они также хотят поблагодарить следующих лиц за помощь в сборе и идентификации дикорастущих растений: г-жу Хагар Лешнер, менеджера коллекции Гербария Еврейского университета (HUJ), Национальную коллекцию естествознания Еврейского университета, и доктораОри Фрагман-Сапир, главный научный сотрудник Иерусалимского ботанического сада.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы описывает скрининг 17 растений, которые были первоначально отобраны и протестированы на противораковую активность на основе их исторического и традиционного использования в лечении рака. Этот скрининг стал основой для выбора наиболее эффективных растительных экстрактов, которые были дополнительно детально изучены на предмет их противораковой активности.

  1. Дополнительные материалы
.

VI Лекарственные растения: обзор

  • Home
    • О UVI-CCAM
      • Команда медсестер CCAM
      • UVI-CCAM Группа химии / биологии
      • Группа по сохранению растений / документации UVI-CCAM
      • Исследователи UVI-CCAM
      • Исследователи UVI-CCAM
    • Phen водно-болотных угодий: кого это волнует?
    • Сметанное яблоко, рекомендованное растение UVI-CCAM
    • UVI-CCAM 2011 Тезисы к летнему научному симпозиуму
  • Наши исследователи
  • VI Краткий обзор растений
    • Библиография / ссылки
    • Токсичные растения для домашних животных
    • Полезные аборигенные растения в VI Место обитания
      • Аборигенные сухие лесные растения
      • Аборигенные влажные лесные растения
      • Аборигенные заболоченные растения
    • VI Внутренние растения качества воздуха
    • VI Лекарственные растения вкратце

.

Последние статьи журнала прикладных исследований лекарственных и ароматических растений

Недавно опубликованные статьи из журнала прикладных исследований лекарственных и ароматических растений.


Хасан Теймори | Хамидреза Балучи | Али Моради | Элиас Солтани
Индань Юань | Xinggang Tang | Сиан Лю | Джинчи Чжан
Мухаммад Ясин | Хавар Джабран | Ирфан Афзал | Шахид Икбал | Мухаммад А.Наваз | Аамир Махмуд | Мухаммад Асиф | Мухаммад А. Надим | Зия Ур Рахман | Мухаммад Аднан | Манахил Сиддики | Мухаммад К. Шахид | Кристиан Андреасен
Махдия Хабиболлахи | Хамид Реза Кавуси | Азаде Лохрасби-Неджад | Сара Альсадат Рахпейма
Бритт Маэстрони | Наталья Бесиль | Алехандра Бохорге | Наталья Герез | Андрес Перес-Парада | Эндрю Каннаван | Горацио Хайнцен | Мария В.Чезио
Фахми А.С. Хасан | Исмаил А. Исмаил | Рагиа Мазроу | Мохамед Хасан
Митали Махаджан | Раджу Куири | Пробир К. Пал
Гуйшэн Ли | Ючунь Чен | Ронгбо Ван | Хунтао Ван | Иньпин Ван
Sharanyakanth Paatre Shashikanthalu | Локесвари Рамиредди | Махендран Радхакришнан
Николай I.Канабарро | Присцилла К. Вегги | Рената Варданега | Марсио А. Мазутти | Мария ду Карму Феррейра
Бусаракорн Махайоти | Тифарат Тамсала | Pramote Khuwijitjaru | Серм Джанджай
Хосе Жак Гарсес | Каролина Гарсия Финклер да Силва | Алин Мачадо Лукас | Ана Луиза Фианко | Рафаэль Нолибос Алмейда | Эдуардо Кассель | Рубем Марио Фигейро Варгас
Xingyu Liu | Hong Ou | Чжаобао Сян | Ганс Грегерсен
Сиюань Ло | Чен Цзэн | Фэнся Луо | Мэн Ли | Шилинг Фэн | Лицзюнь Чжоу | Тао Чен | Мин Юань | Ян Хуан | Chunbang Ding
Рипу М.Кунвар | Бхагават Римал | Хари П. Шарма | Рам К. Пудель | Дипеш Пякурель | Ачют Тивари | Сантош Т. Магар | Гьянендра Карки | Гаури С. Бхандари | Прамод Пандей | Райнер В. Буссманн
Schéhérazade Krim | Рашида Рихани | Люк Маршал | Ален Фуко | Фатиха Бентахар | Джек Легран
Шашиканта Бехера | Кедар К.Маршрут | Пратап С. Панда | Сумендра К. Найк
S.G. Eswara Reddy | Шалини Рана | Арти Рана | Ракеш Кумар
Девася П. Сингх | Амит Кумар | Верина Родригес | Камасамудра Н. Прабху | Амит Кошик | Дая Н.Мани | Ашутош К. Шукла | Велусами Сундаресан
Саид Мури | Мохаммад Дж. Ахмади-Лахиджани
Янг Джин Ким | Хе Мин Ким | Хён Мин Ким | Хе Ри Ли | Byoung Ryong Jeong | Хён-Чон Ли | Хён-Джин Ким | Сеунг Джэ Хван
Хади Хашеми Гахруи | Карим Парастоуи | Мохсен Мохтарян | Хосейн Ростами | Мехрдад Ниакусари | Зиба Мохсенпур
Мохамед Бен Эль Каид | Латифа Салака | Сумайя Эль Мерзуги | Хадиджа Лачгер | Халид Лаграм | Абдельхамид Эль Мусадик | Мохаммед Амин Сергини
Бузид Неджими | Захрат Э.Суиси | Брахим Гит | Юсеф Дауд
Манаби Лапа | Сунита Мунда | Ангана Бора | Судин Кр. Панди | Мохан Лал
Аджой Саха | Чинтан Маквана | Рам П. Мина | Понучамы Манивель
Муруган Раджан | Гомати Раджкумар | Тамна Джоанан Фариас Лима Гедес | Роми Глейз Шагас Баррос | Нарендра Нараин
Лени М.Идрис | Росима Нулит | Фарида Камаруз Заман | Фатин К. Арифин
Суровый К. Чаухан | Анил К. Бишт | Индра Д. Бхатт | Арвинд Бхатт
Эрман Бейзи | Билал Гюрбюз
Шиха Шарма | Свати Валиа | Шалика Ратор | Паван Кумар | Ракеш Кумар
Разейх Багери | Масуд Дехдари | Амин Салехи
Maitreyee Kundu | Shweta Tiwari | Маниша Халдкар
Рамоаги Т.Сегон | Сидони Ю. Танкеу | Вэйян Чен | Сандра Комбринк | Матиас Шмидт | Альваро Вилджоэн
Джулиана де Брито Майя Миамото | Smail Aazza | Наталия Риттер Руас | Александр Алвес де Карвалью | Хосе Эдуардо Бразил Перейра Пинто | Лучиана Вилела Ресенде | Сьюзан Келли Вилела Бертолуччи
Николас Нагахама | Марсело Ф.Бонино
Ана ЮРИНЯК ТУШЕК | Тамара ЮРИНА | Майя БЕНКОВИЧ | Давор ВАЛИНГЕР | Ана БЕЛЩАК-ЦВИТАНОВИЧ | Ясенка ГАЙДОШ КЛЮСУРИ
Захра Гарари | Хадидже Багери | Хоссейн Данафар | Али Шарафи
Серап Кёпрю | Рабиа Сэй | Кевсер Караман | Мустафа Мюкахит Йилмаз | Махмут Каплан
Сон-И Пак | Джи-Хун Бэ | Мён Мин О
Бандана Дхиман | Прашант Шарма | Шивани | Пробир К.Приятель
Рам Прашна Мина | Сатьяджит Рой
Efstathia Patelou | Paschalina Chatzopoulou | Алексиос Н. Полидорос | Фотини В. Милона
Бирендра Кумар | Приянка Прасад | Джафар Мехди | Аканча Гупта | Каруна Шанкер | Манджу Сингх | Раджни Гаутам | Хемант Кумар Ядав
Бернхард Клиер | Эльмар Хефнер | Хаген Альберт | Джеральд Биндер | Маттиас Кнёдлер | Мартин Кюн | Александр Шенк | Барбара Стейнхофф
Валентина А.Сагарадзе | Елена Ю. Бабаева | Роман Александрович Уфимов | Николай Алексеевич Трусов | Елена Ивановна Каленикова
Рутуя С. Палкар | Кришнан Селлаппан
Каталин Патонай | Хельга Салонтай | Юлианна Чугани | Орсоля Сабо-Худак | Эрика Пензесне Конья | Эва Замборине Немет .

Смотрите также




© 2012 - 2020 "Познавательный портал yznai-ka.ru!". Содержание, карта сайта.